L’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïde (ICSI) chez la jument

Ponction d’ovocytes d’une jument donneuse, maturation des ovocytes in vitro, injection d’un spermatozoïde dans un ovocyte mature, développement de l’ovocyte fécondé in vitro, transfert d’embryon… zoom sur l’injection intra-cytoplasmique de spermatozoïde (intra-cytoplasmic sperm injection en anglais ou ICSI), une biotechnologie de la reproduction certes coûteuse mais prometteuse, de plus en plus demandée dans la filière équine.

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par Maud CAILLAUD - Laurie BRIOT - | 02.03.2020 |
Niveau de technicité :
microscope équipé de micromanipulateurs
Sommaire

Qu’est-ce que l’ICSI ?

L’intra-cytoplasmic sperm injection (ICSI) est une biotechnologie de la reproduction qui consiste à injecter un spermatozoïde directement dans un ovocyte mature (c’est-à-dire apte à la fécondation). Ce dernier, ainsi fécondé, est mis en développement in vitro pendant une semaine jusqu’à atteindre le stade blastocyste. L’embryon est ensuite réimplanté immédiatement dans une jument receveuse ou congelé dans l’azote liquide pour un transfert ultérieur.

Cette technique n’est pas spécifique à l’espèce équine. Elle est notamment utilisée en médecine humaine lorsque la fécondation in vitro (FIV) classique n’est pas utilisable (faible qualité de semence). Dans l’espèce équine, la FIV classique ne fonctionne pas, d’où l’intérêt de développer cette technique pour la filière, qui est depuis quelques années très demandeuse au vu des résultats.

Quelles sont les différentes étapes de l’ICSI ?

1) Récolte des ovocytes de la jument donneuse

Les ovocytes sont récoltés par ponction transvaginale écho-guidée. La jument donneuse est placée dans une barre de contention et est tranquillisée et analgésiée afin d’éviter toute douleur. Un premier opérateur introduit dans le vagin une sonde échographique et va en parallèle, via le rectum, maintenir l’ovaire et le placer devant cette sonde de manière à pouvoir voir les tissus ovariens sur l’échographe.

Un second opérateur va introduire, dans un guide situé le long de la sonde échographique, une aiguille permettant de transpercer les follicules et d’aspirer le liquide folliculaire pour récupérer les ovocytes. Les ovocytes équins étant attachés à la paroi du follicule, il est nécessaire de procéder par rinçages successifs de la cavité folliculaire et, par des mouvements rotatifs de l’aiguille, l’opérateur va gratter la paroi du follicule.

Un troisième opérateur s’assure du confort de la jument et reste vigilant au moindre signe de souffrance de l’animal. Il pourra être amené à réaliser de nouvelles injections de tranquillisant et/ou analgésiant. Cette personne peut également transmettre les fluides collectés au fur et à mesure au laboratoire.

2) Recherche des ovocytes sous loupe binoculaire

Une fois collectés, les liquides sont filtrés puis observés sous loupe binoculaire placée dans une hotte à flux laminaire horizontal pour rester dans un environnement stérile.

3) Maturation des ovocytes in vitro

Les ovocytes immatures récoltés sont mis en maturation dans des conditions atmosphériques particulières (5% de CO2, 38,5°C) pendant 28 à 30 heures. L’objectif de cette étape est l’obtention d’un ovocyte apte à la fécondation, correspondant au stade métaphase II, où une partie du matériel génétique a été expulsé dans le globule polaire.

4) Injection du spermatozoïde dans l’ovocyte

Grace à un système de micromanipulateurs montés sur un microscope, l’ovocyte est maintenu en place et un spermatozoïde est injecté directement à l’intérieur via une pipette d’injection.

Au préalable de cette injection, les spermatozoïdes sont ralentis dans un milieu visqueux et leur flagelle est immobilisé pour permettre leur aspiration dans la pipette et l’injection sans risquer de provoquer des dégâts sur le cytosquelette du cytoplasme.

5) Développement des ovocytes fécondés in vitro

Une fois l’injection du spermatozoïde dans l’ooplasme réalisée, les ovocytes fécondés sont de nouveau placés dans un incubateur. La culture va durer au minimum 7 jours dans une atmosphère à 5% de CO2 et 5% d’O2, à une température de 38,5°C. Les ovocytes fécondés pourront se développer pour atteindre le stade transférable, c’est-à-dire le stade blastocyste.

6) Transfert de l’embryon dans une jument receveuse

L’embryon peut ensuite être transféré dans une jument receveuse si celle-ci est synchrone avec la fin de la culture, soit 5 à 6 jours après sa propre ovulation.

L’autre possibilité est la congélation de l’embryon pour permettre de différer à la fois dans le temps et dans l’espace sa réimplantation dans une receveuse dans des conditions plus favorables.

Que peut-on attendre comme résultat pour cette technique ?

Chiffres publiés par le laboratoire Avantea du Pr Galli en Italie

Le taux de collecte des ovocytes par ponction transvaginale sur des follicules immatures est en moyenne de 50%. Il peut atteindre 60% pour une équipe de ponction expérimentée avec du matériel performant.

Le taux de maturation in vitro des ovocytes se situe entre 65 et 70% si les ovocytes sont mis en incubateur à la suite de la collecte. Ce taux est légèrement inférieur (55-60%) si les ovocytes sont transportés 24 heures avant l’incubation.

Après la fécondation par ICSI, le taux de blastocystes obtenus lors du développement in vitro est beaucoup plus faible, de l’ordre de 17 à 20%.

Au final, le nombre de blastocystes obtenus en moyenne par séance de ponction est de 1,2.

Divers facteurs influant sur la réussite de l'ICSI

Plusieurs facteurs peuvent influencer négativement les résultats. En effet, la qualité de l’ovocyte diminue avec l’âge de la jument donneuse. La saison peut également influer. Les résultats sont diminués lors de l’anoestrus profond de la jument. De plus, la qualité de la semence de l’étalon utilisé peut aussi entrer en ligne de compte ou encore le nombre d’étalons utilisés sur une même séance d’ICSI, entraînant un temps de préparation de la semence plus long et donc un temps d’attente des ovocytes également plus long.

Cependant, il faut souligner qu’indépendamment de tous ces facteurs de variation, il y a un effet « jument » inévitable. Une jument pourra donner plusieurs embryons pour chaque séance de ponction alors qu’une autre jument n’en donnera jamais, quel que soit l’étalon utilisé.

L’ICSI : pour quelles juments ?

Cette technique est dans la plupart des cas réservée :

  • Aux juments ayant des problèmes d’ovulation, des problèmes au niveau de l’oviducte ou encore de l’utérus
  • Aux juments âgées où le transfert d’embryon ne donne aucun résultat
  • Aux juments mises à la reproduction avec des étalons dont la semence est de mauvaise qualité ou si l’étalon en question est mort et son stock de paillettes très restreint

Mise en place d’un statut sanitaire spécifique pour les juments donneuses

Dans le centre de prélèvement, un circuit spécifique à ces juments doit être appliqué. Elles doivent être hébergées dans une écurie ou un paddock dédié(e) et ne pas être en contact avec des chevaux de statut sanitaire inférieur. Les juments donneuses doivent également répondre à plusieurs exigences sanitaires :

  • Elles ne doivent pas avoir été mises à la reproduction en monte naturelle dans les 30 jours qui précèdent la ponction ovocytaire.
  • Les vaccinations contre la grippe et la rhinopneumonie doivent être à jour.
  • Le dépistage pour l’anémie infectieuse  via un « test de Coggins » doit avoir été réalisé au moins 90 jours avant la période de collecte.
  • Le dépistage de la métrite contagieuse équine doit être réalisé avec un résultat négatif sur deux écouvillons (fosses et sinus clitoridiens) via deux bactériologies à 7 jours d’intervalle ou une PCR.

Un certificat sanitaire conforme au modèle IIA de la directive 2015/261/UE doit accompagner les ovocytes ou les embryons.

Où en est-on en France ?

Aujourd’hui, quelques centres réalisent des ponctions transvaginales écho-guidées en France. Les ovocytes sont ensuite conditionnés dans un milieu spécifique et envoyés à l’étranger, notamment en Italie, dans des laboratoires spécialisés réalisant la technique d’ICSI en routine. Les blastocystes obtenus sur place au laboratoire peuvent être soit transférés immédiatement si le centre réalise des transferts d’embryons, soit congelés et donc renvoyés en France pour leur transfert ultérieur.

En ce qui concerne la procédure d’ICSI, il n’existe pas à ce jour de laboratoire spécialisé en France. Plusieurs centres sont équipés du matériel de micromanipulation mais le geste technique d’ICSI nécessite un long apprentissage pour être totalement maîtrisé. De plus, l’équipement d’un laboratoire complet pour réaliser la procédure entière est très coûteux (environ 250 000€), auquel il faut rajouter le consommable.

Cette biotechnologie de la reproduction nécessitant des moyens matériels et des compétences techniques pointues, son coût est élevé et peut avoisiner les 7 000€ hors frais de génétique.

Risques liés à l’utilisation de la ponction transvaginale écho-guidée

L’utilisation de la ponction ovocytaire est une technique assez invasive qui n’est pas sans risques. Même si ceux-ci sont faibles, il est important de noter : atteinte de l’ovaire, infection de l’ovaire ou de l’abdomen, problèmes suite aux injections médicales. Le client qui amène sa jument dans un centre de ponctions doit être averti des risques que sa jument encourt lors d’une séance.

Administratif lié à cette technique

Face à l’engouement de la filière pour cette technique, les étalonniers s’organisent et proposent maintenant des contrats de vente de paillettes spécifiquement pour l’ICSI.

Du côté du SIRE, des réflexions sont menées pour pouvoir permettre de déclarer des naissances plusieurs années après la conception de l’embryon. A suivre de ce côté-là…

Dernières publications issues du congrès de l’ISER 2018 : principaux résultats

Dans une étude rétrospective sur 559 embryons issus d’ICSI, il a été montré que la jument receveuse doit être à J+4 post-ovulation pour être dans les conditions optimales de réimplantation d’un embryon issu d’ICSI congelé (Cuervo-Arango et al., 2019).

Une autre étude récente montre que les embryons issus d’ICSI congelés donnent un pourcentage plus faible de gestation et de poulinage par rapport aux embryons in vivo frais, et significativement plus de mâles. De plus, les embryons qui se développent le plus rapidement (atteinte du stade blastocyste en 7 jours) ont plus de chances de donner un poulain (et même un mâle !) (Claes et al., 2018).

En savoir plus sur nos auteurs
  • Maud CAILLAUD Formatrice IFCE
  • Laurie BRIOT Ingénieur de recherche IFCE
Bibliographie
  • CLAES A., CUERVO-ARANGO J., COLLEONI S., LAZZARI G., GALLI C. and STOUT T.A., 2018. Production and sex ratio of foals after transfer of frozen-thawed in vitro produced embryos. Journal of Equine Veterinary Science, 66, page 176.
  • CUERVO-ARANGO J., CLAES ANTHONY A.N. and STOUT T.A.E., 2019. In vitro-produced horse embryos exhibit a very narrow window of acceptable recipient mare uterine synchrony compared with in vivo-derived embryos. Reproduction, Fertility and Development, 31, pages 1904-1911.
Pour retrouver ce document: www.equipedia.ifce.fr
Date d'édition: 25 10 2020
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