Insémination artificielle de sperme frais (IAF) : technique 20 millions de spermatozoïdes / ml

Le conditionnement se fait en tubes de 10 ml ou en seringues de 20 ml. 

Pour ralentir la descente de température des doses réfrigérées, les tubes de 10 ml sont placés dans des tubes de 50 ml (tubes « air ») et les seringues sont mises dans des manchons de mousse isotherme (seringue « manchon »).

Avantage

Les IA peuvent être immédiates ou réfrigérées quelques heures à 4°C (concentration optimale pour la conservation).

Inconvénient

Le sperme n’est pas utilisé en totalité. On prépare seulement les doses nécessaires en fonction du nombre de juments programmé.

Avant la récolte

Connaître le nombre n de doses à préparer :

• n = nombre de juments à inséminer
• + 2 doses pour les survies 24 et 48 heures
• + 1 dose pour s’affranchir des problèmes de pipetage

Soit n+3 doses à préparer pour n juments à inséminer

• Mettre (n+3) x 10 ml de dilueur au bain-marie à 35°C dans un flacon à large ouverture.
• Pour les doses en seringue, couper un cathéter à une longueur de 15 cm avec des ciseaux propres, ou mieux, utiliser une paille Aspisem (IMV).
• Étiqueter les n+2 seringues ou tubes qui contiendront les doses/survies (nom de l’étalon et date). Utiliser si possible une couleur différente par étalon.
• Mettre à l’étuve les pipettes de 10 ml ou 20 ml, le cathéter coupé ou Aspisem, tubes air, seringues, manchons de mousse.
• Mettre sur la platine chauffante : lames, lamelles, cônes de pipette, bouchons des seringues.

Préparation en vrac (conditionnement en seringues)

• Mettre n x 5 ml de dilueur dans un flacon à large ouverture placé au bain-marie.

Préparation en tubes

• Mettre 5 ml de dilueur dans n tubes de 10 ml placés au bain-marie, étiquetés au nom du cheval. Boucher les tubes afin d’éviter que des gouttes d’eau y pénètrent.
• Préparer le matériel de filtration (entonnoir et gaze, flacon ou biberon) et les placer à l’étuve jusqu’à l’utilisation.
• Mettre 3,9 ml (ou 1,9 ml selon le modèle de spectrophotomètre) de sérum physiologique dans la cuve photométrique.
• Faire le zéro dans le spectrophotomètre.

Remarque : Dans une «préparation en tubes», les tubes étiquetés au nom de l’étalon sont placés au bain marie. 5 ml de dilueur sont mis dans chaque, à la pipette. Ils seront ensuite rebouchés.

Après la récolte

Filtrer le sperme. La filtration de la semence est une étape incontournable quel que soit le choix de préparation des doses (en vrac ou en tubes). 

Mesurer la concentration (spectrophotomètre).

Calculer le volume V de sperme contenant 200.10⁶ millions de spermatozoïdes : V = 200/C

Préparation en vrac (conditionnement en seringues)

• Ajouter dans le flacon de dilution : n x V ml de sperme.
• Compléter avec n x (5-V) ml de dilueur.
• Apprécier la mobilité du sperme à partir de deux gouttes prélevées dans le flacon.

Préparation en tubes

• Ajouter dans chaque tube le volume V de sperme (V = 200/C).
• Compléter avec (5-V) ml de dilueur.  
• Apprécier la mobilité du sperme dilué après agitation à partir de 2 gouttes prélevées dans 2 tubes différents.

Sortir de l’étuve les seringues, bouchons, manchons mousse et l’Aspisem.

Remplir les seringues à partir du flacon en aspirant jusqu’à la graduation 10 ml, à l’aide de l’Aspisem. Veiller à ne pas laisser d’air dans la seringue.

Les doses de 10 ml de semence diluée sont :

• Soit toutes conditionnées en seringue de 20 ml, bouchées, emballées dans un manchon de mousse isotherme et placées dans le laboratoire à température ambiante.
• Soit mises en seringue de 20 ml au fur et à mesure des inséminations, le flacon de sperme dilué restant sur la paillasse du laboratoire jusqu’à la fin des inséminations.

Veiller à ce que la température ambiante reste > 20°C. Les cathéters d’IA doivent être mis au préalable à l’étuve.

Conditionnement

Doses en seringues

Placer au réfrigérateur les seringues bouchées et enfilées dans un manchon.

Doses en tube

Mettre le bouchon d'origine sur le tube et placer le tube à l'intérieur du tube air bien vissé.

Portoirs

Pour les IA différées refroidies à 4°C, les seringues manchon ou les tubes air sont placés en position verticale dans des portoirs au réfrigérateur à 4°C.

Veiller à maintenir une circulation d’air suffisante entre les doses.

Température

Vérifier que le réfrigérateur maintient bien cette température de 4°C.

Planifier les contrôles de température des matériels (thermomètres à mémoire Testo).

Mise en place

Avant utilisation, les doses sont agitées par retournements successifs.

Les cathéters (et les seringues pour les doses en tubes) sont maintenus à température ambiante jusqu’à leur utilisation.

Toutes les données de récolte doivent être enregistrées. Les contrôles de qualité à 24 et 48 heures constituent le meilleur critère de fertilité in vitro de la semence.

En pratique, il est conseillé d’effectuer au minimum chaque semaine :

• 1 contrôle de qualité en fin de séance de préparation des doses, et à chaque doute sur la préparation ou la conservation des doses 
• 2 contrôles de qualité après 24 heures à 4°C 
• 1 contrôle de qualité après 48 heures à 4°C

La dose d’IA utilisée pour la survie est conditionnée de façon identique à celles inséminées. Le dilueur utilisé est le même que celui utilisé pour fabriquer les doses.

Doses en seringues

• Sortir la seringue de son manchon, enlever le bouchon, aspirer 1 ml d’air, agiter et placer les 10 ml dans un tube cristal placé au bain-marie
• Boucher
• Après 10 min, agiter le tube et observer 2 gouttes au microscope

Doses en tubes

• Sortir le tube air du réfrigérateur, en extraire le tube de 10 ml, agiter et placer le tube toujours bouché 10 mn au bain-marie à 35°C
• Après 10 mn, agiter à nouveau le tube, déboucher et observer 2 gouttes au microscope

Il n’est pas nécessaire d’utiliser des antibiotiques dans le dilueur si toutes les doses sont utilisées immédiatement. En revanche, si l’on conserve quelques doses au cas où une jument non prévue se présenterait, le dilueur doit contenir des antibiotiques.

Si la concentration du sperme est inférieure à 60 millions par ml, il n’est pas possible d’effectuer une dose de 10 ml avec 200 millions de spz ; on utilisera :

• Soit la technique 2/3 - 1/3. La dose aura toujours un volume supérieur à 10 ml.
• Soit faire des doses à 200 millions de spz dans 20 ml : mettre un volume de sperme correspondant à 200 millions de spz (V = 200/C) et compléter avec au moins 2 x V ml de dilueur et/ou jusqu’à 20 ml.

Si un étalon a régulièrement une concentration de moins de 60 millions par ml, il doit :

• Soit être récolté en vagin artificiel ouvert. Attention à la perte de spermatozoïdes (– 30%)
• Ou bien être utilisé en IA immédiate (le sperme n’est pas suffisamment dilué pour se conserver)
• Ou bien être utilisé en monte naturelle

Idéal : 4 fois par semaine

Si 3 récoltes par semaine (pour des étalons dont la semence conservée est de bonne qualité) :

• Le vendredi, prévoir 2 doses par jument
• A l’arrivée : inséminer la jument avec une dose et mettre l’autre dose au réfrigérateur
• Le samedi : inséminer la jument avec la deuxième dose