L'utilisation du milieu INRA 96

1. Dilution rapide du sperme pur tout en évitant les chocs mécaniques et thermiques (dans un bain marie à 35°C ).

2. Nombre de spermatozoïdes minimum par dose d’insémination :

• 200x 10⁶ de spermatozoïdes totaux en insémination artificielle immédiate (IAI) et réfrigérée transportée (IARP) < à 12h00
• 200 à 400x 10⁶ spermatozoïdes totaux en IA réfrigérée transportée (IART) > à 12h00 (selon les étalons).  

En insémination artificielle de semence congelée, le nombre de spermatozoïdes totaux est de 400x 10⁶.

3. Dilution minimum : 1 volume de sperme maximum pour 2 volumes de milieu minimum. Ceci afin d’éviter l’effet négatif du plasma séminal.

4. Volume de la dose d’insémination artificielle de semence fraîche ou réfrigérée : compris entre 10 et 20 ml.

Les différents protocoles de conservation de la semence tiennent compte des essais et des résultats in vitro et in vivo obtenus à l’INRA de Nouzilly (Unité Physiologique de la Reproduction et des Comportements, Unité Expérimentale de Physiologie Animale de l'Ofrasière), dans les centres techniques et les centres expérimentaux des Haras nationaux, depuis de très nombreuses années.

Le milieu INRA 96 est composé d’une solution de sels et de sucres ainsi que de la fraction purifiée des caséines du lait ou PPCN (phosphocaséinate natif). Ce milieu contient des antibiotiques aux concentrations habituellement utilisées, c’est-à-dire 50 UI/ml de pénicilline et 50µg/ml de gentamicine. De plus, il contient un antifongique, l’amphotéricine B (0,25µg/mL) (Batellier et al., 1997).

Il a montré son efficacité après 24 heures de conservation à la température de 15°C et 4°C. Les résultats obtenus après 24 heures de conservation (résultats de 1994 à 1996) montrent que la fertilité de certains étalons, dont la semence ne supporte pas les effets néfastes du "cold-shock" lors de la descente de température à 4°C, a été améliorée par la conservation de la semence à 15°C (Batellier et al., 1998). Ces résultats permettent d’envisager, selon les besoins, et en fonction de la qualité de la semence des étalons, d’utiliser le milieu INRA 96 à la fois à la température de 15°C et de 4°C.

Par ailleurs, les résultats obtenus après 72 heures de conservation laissent envisager la possibilité de conserver la semence dans le milieu INRA 96 pendant plus de 24 heures avant insémination (Batellier et al., 2001) tout en maintenant la fertilité (Chanavat et al., 2005 ; Vidament et al., 2005).

Le milieu INRA 96 peut être transporté à température ambiante n’excédant pas 30°C. Pour un stockage prolongé, il est nécessaire de le conserver entre +2°C et +8°C.

Lors de l’ouverture d’un flacon, si la totalité du milieu n’est pas utilisé, il est possible de le fractionner dans des tubes stériles et de le congeler. Cependant, un seul cycle de congélation est acceptable. Lorsque le milieu a été congelé, il est recommandé de le décongeler à l’eau tiède (35 - 40°C) et éviter de l’agiter violemment (problème de « mousse »).

Le protocole de préparation de doses d’IA avec le milieu INRA 96 ne diffère que peu ou pas de celui utilisant tout autre milieu de dilution en vue d’insémination artificielle de semence fraîche, réfrigérée avec ou sans transport de doses.

• Déterminer le nombre de doses d’inséminations à préparer, prélever le volume de milieu nécessaire et le mettre au bain marie à 35°C en attendant la collecte de la semence. Si n doses d’insémination sont nécessaires, prélever n+1 x10ml de milieu. 
• Collecter la semence, la filtrer puis évaluer sa concentration en spermatozoïdes à l’aide du photomètre.
• Diluer la semence à la concentration finale de 20x10⁶ spermatozoïdes par ml ou moins en fonction de la concentration de la semence pure de l’étalon.
• Conditionner la semence diluée en doses de 10ml (ou plus en fonction de l’étape précédente) pour l’inséminer immédiatement ou la conserver en vue d’inséminations différées.

Il est à noter que l’ensemble des résultats obtenus à Nouzilly lors d’IA différées 24H ou plus l’ont été avec des doses de 200 millions de spermatozoïdes totaux.

Une des caractéristiques du milieu INRA 96 est de permettre de conserver la semence à la température de 4°C ou 15°C. Cependant le conditionnement diffère en fonction de la température.

Conservation à 4 °C

A cette température, il existe des containers autonomes (ou boîte de transport de semence) qui maintiennent la température à 4°C. Le transport est alors possible.

Conservation à 15°C

A cette température, il n’existe pas de containers autonomes qui maintiennent la température à 15°C. Il est recommandé de contrôler régulièrement la température de conservation en utilisant une sonde enregistreuse.